專訪篇
目前在人源化小鼠模型的研究過程中，還存在哪些問題，還有哪些改進(jìn)方法與策略？人源化小鼠在哪些領(lǐng)域應(yīng)用？為此，本期中國實驗動物信息網(wǎng)特邀賽業(yè)模式生物高級科學(xué)家俞曉峰博士為大家詳細(xì)講解。
中國實驗動物信息網(wǎng)：為什么要構(gòu)建人源化小鼠模型？人源化小鼠模型的發(fā)展歷程？
俞博士：將人基因、細(xì)胞與組織通過基因修飾或移植到免疫缺陷小鼠的方式來構(gòu)建的小鼠模型即為人源化小鼠模型。人源化小鼠模型已經(jīng)成為研究人類疾病的重要臨床前動物實驗模型。
由于直接利用人細(xì)胞及組織進(jìn)行相關(guān)研究受到邏輯與倫理方面的限制，動物模型就成為人類生物學(xué)研究的替代選擇。小鼠因體積小，易維持與操作，繁殖周期短， 與人在基因組和生理學(xué)等特征方面相似，以及已經(jīng)有相應(yīng)成熟的基因修飾技術(shù)方法等因素，使其成為廣泛應(yīng)用的哺乳動物模式生物系統(tǒng)。
盡管小鼠模型研究已經(jīng)取得了大量基礎(chǔ)生物學(xué)相關(guān)方面成果，然而，對于揭示人類生物學(xué)方面，小鼠模型仍然存在局限性。小鼠生物系統(tǒng)中，特別是免疫系統(tǒng)，與人不完全一致，突出表現(xiàn)在先天免疫分子方面存在許多的不同，例如，小鼠缺乏功能性的TLR10，而在小鼠體內(nèi)表達(dá)的TLR11、 TLR12 和TLR13，在人體內(nèi)卻是沒有的。
而且，許多人致病因子和藥物具有種系特異性。某些病原體引起的免疫反應(yīng)特性與致病過程只針對人細(xì)胞，往往不是小鼠的感染病原體。由于這些問題及因素的存在，限制了小鼠模型成為真正能全面揭示人類生物學(xué)系統(tǒng)等研究的可靠性及有效工具。
因此，建立有效的人源化小鼠模型作為研究人特異性感染病原體，癌癥生物學(xué)及其免疫治療的臨床前模型等方面，將發(fā)揮著越來越重要的作用。另外，人源化小鼠作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)模型，包括再生醫(yī)學(xué)、移植和免疫學(xué)等生物學(xué)研究的需求也在不斷增加。
早期的人源化小鼠模型的建立多是通過移植人細(xì)胞或組織至免疫缺陷小鼠來實現(xiàn)的。最早的人源化小鼠模型建立要追溯到1962年應(yīng)用無胸腺裸鼠，然后是1983年因Prkdc基因缺失的SCID小鼠及1995年NOD-SCID小鼠的應(yīng)用。然而，免疫缺陷小鼠應(yīng)用的真正突變性進(jìn)展發(fā)生在2000年早期，在原免疫缺陷的小鼠（如NOD-SCID) 的基礎(chǔ)上，通過將IL2受體的伽馬(γ） 共用鏈（IL2rg)敲除，而成功研制出新型免疫缺陷IL2rg小鼠。由于該共用γ鏈?zhǔn)前ㄔS多細(xì)胞因子（如IL2，IL4，IL7，IL9，IL15和IL21）受體重要組成部分，所以IL2rg是這些細(xì)胞因子高親和力結(jié)合與信號傳遞不可缺少的成分。因此，在NOD/SCID 突變，或Rag1/Rag2突變基礎(chǔ)上，同時敲除小鼠IL2rg結(jié)構(gòu)部分而構(gòu)建的免疫缺陷IL2rg小鼠，具有先天免疫缺失（包括無小鼠NK細(xì)胞）和獲得性免疫都明顯缺失的特征。
目前，廣泛應(yīng)用的免疫缺陷IL2rg小鼠有三種：1. 2002年日本CIEA研制的NOG (NOD Shi. Cg-Prkdc IL2rg)； 2. 2005年JAX研制的NSG（NOD. Cg-Prkdc IL2rg)，3. 2004年日本CIEA的BRG (BALB/c-Rag2 IL2rg)。NOG小鼠含有縮短γ鏈胞漿部分，雖然此部分可以結(jié)合細(xì)胞因子，但因無信號域部分，所以無信號傳遞功能；而NSG和BRG小鼠則完全缺失γ鏈部分。與以前的人源化小鼠（如NOD-SCID）相比，當(dāng)人細(xì)胞，組織和免疫系統(tǒng)移植至小鼠體內(nèi)后，在此類人源化小鼠體內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)更能真實地反應(yīng)人體內(nèi)的生物學(xué)現(xiàn)象。
中國實驗動物信息網(wǎng)：建立在免疫缺陷小鼠基礎(chǔ)上的人源化小鼠模型有哪幾種主要的構(gòu)建方法？
俞博士：目前，通過將人細(xì)胞及組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，實現(xiàn)人源化小鼠模型建立的方式，由于其操作過程相對簡單，效率高，且成本低，所以用該方法建立人源化小鼠已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人感染性疾病，癌癥，再生醫(yī)學(xué)，移植與宿主，過敏和免疫等領(lǐng)域的基礎(chǔ)與臨床前實驗動物模型的研究。目前應(yīng)用免疫缺陷小鼠構(gòu)建人免疫系統(tǒng)，通常有三種方法。1. Hu-PBL-SCID模型，借助注射人外周血白細(xì)胞實現(xiàn)。該方法可以很快（第一周末）就可以獲得人CD3 + T細(xì)胞，是體內(nèi)研究人T細(xì)胞功能的極好模型。由于致死異種導(dǎo)致的移植物抗宿主疾?。℅VHD)的形成，該方法的缺點(diǎn)是實驗觀察窗口較短（通常只有4-8周）, 但此實驗窗口期可以通過改造NSG小鼠，使其缺失MHC-I或II得到延長。
2. Hu-SRC-SCID模型， 通過靜脈或股骨內(nèi)注射來自人骨髓，臍帶血，胎肝，或G-CSF激活的外周血等的人CD34 + HSC細(xì)胞。該模型支持完整的人免疫系統(tǒng)的移植。 雖然，B細(xì)胞，T細(xì)胞，髓系細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞（APCs) 存在于外周造血干細(xì)胞，但是，在小鼠血液中觀察到的來自骨髓的粒細(xì)胞，血小板和紅細(xì)胞的量卻非常低。而且，小鼠胸腺通常缺乏一些可以完全模擬人T細(xì)胞成熟所需要的相應(yīng)人特異性因子。
3. BLT模型（Bone marrow/liver/thymus)模型， 該模型的建立是通過腎囊和靜脈血管注射，移植人胚胎干和胸腺?？梢孕纬奢^強(qiáng)的人粘膜免疫系統(tǒng)，以及自體同源人胸腺的HLA限制的人T細(xì)胞。然而，在許多實驗室實際操作時，小鼠會出現(xiàn)GVHD樣綜合癥，從而限制了實驗窗口期。
每種模型都有其優(yōu)勢與不足，研究者需要根據(jù)自己特殊的研究目的，需要解決的特殊生物學(xué)問題，選擇合適的構(gòu)建方法。
中國實驗動物信息網(wǎng)： 針對目前常用免疫缺陷小鼠模型存在的問題，有哪些改進(jìn)方法與策略？
俞博士：雖然相對于早期的免疫缺陷小鼠（如SCID, NOD-SCID等），免疫缺陷IL2rg小鼠已經(jīng)具有支持人細(xì)胞，組織和免疫系統(tǒng)成功移植的能力。然而，為了進(jìn)一步改善該模型在實際應(yīng)用中存在的某些不足，在此類模型基礎(chǔ)上，全球許多實驗室也在為進(jìn)一步完善免疫缺陷小鼠模型，研發(fā)更加有效的人疾病模型持續(xù)不斷努力著。在這方面的努力主要集中在如何增加有利于人先天免疫系統(tǒng)和體液免疫發(fā)育成熟與功能效果等領(lǐng)域。
為了改善骨髓細(xì)胞在免疫缺陷IL2rg小鼠中發(fā)育成熟與功能， 研究者們在BRG小鼠的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了人M-CSF, IL-3, SIRPa, TPO, GM-CSF 基因插入的MISTRG小鼠。該小鼠具有表達(dá)功能性的人單核細(xì)胞和NK細(xì)胞能力，而且，在接受人胎干HSC移植和皮下注射人黑色素瘤細(xì)胞系Me290后, M2巨噬細(xì)胞如同在原位腫瘤組織一樣，可以侵潤腫瘤微環(huán)境。與Hu-SRC-SCID NSG腫瘤移植小鼠模型相比，腫瘤生長在Hu-SRC-SCID/MISTRG小鼠中是增加的，提示巨噬細(xì)胞/骨髓細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤生長的作用。
另外，在NOG小鼠背景添加人GM-CSF和IL3構(gòu)建的NOG-hGM-CSF/hIL3小鼠，或在NSG小鼠背景上添加人GM-CSF，IL3和SF（Steel factor)構(gòu)建的SGM3，與NOG/NSG小鼠相比，SGM3小鼠都具有促進(jìn)來自人的骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)發(fā)育成熟的作用。
逐步增加的發(fā)展趨勢表明，這些改進(jìn)的人源化小鼠模型正在被應(yīng)用于人生物學(xué)反應(yīng)和疾病許多研究，且將成為臨床前藥物評價，以及深入探討人疾病發(fā)生機(jī)理潛在機(jī)制的重要工具。
中國實驗動物信息網(wǎng)：目前免疫缺陷小鼠存在的問題與挑戰(zhàn)是什么？
俞博士：目前這些免疫缺陷小鼠存在的主要問題，還是因為小鼠自身存在的先天免疫系統(tǒng)及細(xì)胞因子，仍然阻擾了人淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的發(fā)育成熟與功能。為了解決這一問題，已經(jīng)構(gòu)建了多種敲除小鼠株（包括破壞小鼠粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能等），達(dá)到進(jìn)一步降低小鼠先天免疫的作用。如在移植人HSC后，由于人和小鼠細(xì)胞因子的種系特異性，使得人免疫細(xì)胞的分化和成熟不完全。針對此現(xiàn)象，也可以通過轉(zhuǎn)基因或敲入等基因修飾技術(shù)與方法，將人細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呷毕菪∈蟮幕蚪MDNA中來解決。
應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法的一個潛在的問題，是可能造成小鼠相應(yīng)細(xì)胞因子基因的干擾，表現(xiàn)為雖然可以發(fā)生相應(yīng)的結(jié)合反應(yīng)，但卻無法引起人細(xì)胞因子的相應(yīng)靶信號效應(yīng)。因此，對于許多表達(dá)人分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，建議同時將小鼠相應(yīng)細(xì)胞因子基因進(jìn)行敲除修飾。
另外，針對通過增加人細(xì)胞因子的改進(jìn)型人源化小鼠模型（如MISTRG）小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，該類小鼠表現(xiàn)有較嚴(yán)重貧血癥狀現(xiàn)象，這與人巨噬細(xì)胞對小鼠紅細(xì)胞的損傷，以及來自人HSC對小鼠相應(yīng)HSC的排斥作用可能有關(guān)。
而且，人源化小鼠不完整的體液免疫仍然是沒有解決的問題，這可能與缺乏系統(tǒng)的繼發(fā)淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括免疫刺激后，無法形成有效的類轉(zhuǎn)換和親和力成熟等原因，從而限制了體液免疫反應(yīng)。為了解決此問題，通過增加淋巴組織刺激細(xì)胞發(fā)育，但不需要借助IL2-rg受體的信號的研究努力也正在進(jìn)行。例如，對現(xiàn)有的模型中敲除小鼠MHC類型I和類型II基因的修飾已經(jīng)構(gòu)建成功，當(dāng)作為主要供體人PBMC移植小鼠MHC，可以達(dá)到降低GVHD發(fā)生。這些努力在總體上，增加了改進(jìn)型人源化小鼠人免疫細(xì)胞移植的成功率及功能性。
中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠模型對人感染性疾病方面研究有哪些幫助？
俞博士：人源化小鼠模型為研究那些具有種系特異性致病源，即需要人組織而發(fā)揮其感染及復(fù)制功能，提供了機(jī)會與可能性。通過移植人免疫細(xì)胞至免疫缺陷小鼠，可以使許多人特異性致病源發(fā)揮感染作用。當(dāng)然，根據(jù)需要研究解決問題的不同，需要結(jié)合不同的小鼠品系和移植方法，選擇最為優(yōu)化動物模型。目前，人源化小鼠已經(jīng)有應(yīng)用于包括HIV，登革熱病毒，EB病毒，流感病毒，傷寒/沙門氏菌，結(jié)核桿菌，埃博拉病毒，瘧疾，敗血癥等感染性疾病的研究報道。
人源化小鼠模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人免疫缺陷病毒 （HIV）的研究。1988年應(yīng)用CB17-SCID 小鼠移植人免疫系統(tǒng)的構(gòu)建以前，黑猩猩是用于HIV研究的唯一動物模型。 由于HIV感染人CD4 T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，因而，人源化小鼠模型為體內(nèi)研究HIV不僅提供了可能性，而且已經(jīng)用于HIV感染，疾病發(fā)展過程，潛伏期，以及病毒學(xué)等方面研究。 雖然，一些實驗室應(yīng)用Hu-SRC-SCID模型來研究HIV，但更多的實驗室是用BLT模型，因為這種模型可以獲得移植效率更高的人粘膜系統(tǒng)，從而利于研究HIV在陰道和腸道的傳播機(jī)制。這類模型已經(jīng)應(yīng)用于各種HIV預(yù)防性藥物的測試，抑制HIV復(fù)制及其清除的細(xì)胞治療的評估。
應(yīng)用Hu-PBL-SCID小鼠最早在體內(nèi)揭示了HIV感染，復(fù)制和致病性，而HSC-移植和BLT模型則再現(xiàn)了人感染疾病過程。HSC移植的免疫缺陷小鼠可以被CCR5或CXCX4-熱帶HIV株感染，表現(xiàn)為較長時間（超過一年）的血清病毒血癥。BLT模型已成為研究HIV突變導(dǎo)致逃逸CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的有用模型。
為了努力重現(xiàn)因移植了CCR5缺失供體的骨髓能達(dá)到治愈HIV“柏林病人”現(xiàn)象，有許多研究專注于用抑制CCR5表達(dá)的HSC進(jìn)行小鼠移植實驗。如用ZFN技術(shù)對HSC中CCR5進(jìn)行基因打靶修飾，導(dǎo)致CD4 T細(xì)胞的損失減少及HIV病毒拷貝數(shù)的下降。也有研究者應(yīng)用慢病毒技術(shù)，將特異性作用于CCR5的相應(yīng)microRNA導(dǎo)入至HSCs, 然后將修飾的HSCs移植NSG小鼠，發(fā)現(xiàn)這些小鼠表現(xiàn)為人CD4陽性T細(xì)胞的存在和病毒量的降低，表明該小鼠對CCR5熱帶HIV株感染具有抵抗性。
另外，也有通過構(gòu)建同時針對CCR5和CXCR4熱帶病毒的雙靶點(diǎn)HIV慢病毒表達(dá)載體，達(dá)到不僅可以下調(diào)CCR5，且有可以抵抗CXCR4熱帶病毒的作用。應(yīng)用該雙靶點(diǎn)載體轉(zhuǎn)染的人HSCs來建立NSG-BLT人源化小鼠, 結(jié)果表明，來自這些小鼠的脾細(xì)胞具有在體外抵制CCR5和CXCR4熱帶病毒感染的作用。
中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠在人鼠嵌合肝小鼠模型應(yīng)用中有什么意義？
俞博士：通過建立了人肝嵌合體小鼠模型，可為了研究人肝臟致病因子（如丙型肝炎，乙型肝炎和丁型肝炎等病毒）提供可能性。應(yīng)用這類模型的常用策略是首先破壞小鼠的肝細(xì)胞，使其為移植人肝細(xì)胞提供空間。例如，通常的模型是通過破壞延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah）。另外的方法是，通過表達(dá)可調(diào)控的所謂“毒性/自殺”基因，如尿激酶型纖溶酶原激活子（uPA), 白喉毒素受體（DTR），以及單純皰疹病毒1型胸苷激酶（TK）等基因，發(fā)揮其對肝細(xì)胞的特異性損傷作用。
丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性感染，進(jìn)行性肝硬化，以及導(dǎo)致肝細(xì)胞癌癥的重要誘發(fā)因素。目前，SCID/Alb-uPA和Fah Rag2 IL2rg小鼠已經(jīng)應(yīng)用HCV的研究。近年來更多的研究是利用白蛋白（Alb) 啟動子控制FKBP-capase8融合蛋白（AFC8）表達(dá)的BRG小鼠，通過利用AP20187來去除活性Caspase8的二聚作用，使移植人肝細(xì)胞和HSCs成為可能。研究表明，人肝嵌合小鼠可以被HCV感染，引起人病毒特異性T細(xì)胞對HCV的應(yīng)答及肝纖維化。但是，HCV復(fù)制在小鼠體內(nèi)只觀察到約50%，提示為了能更有效地研究HCV致病性與免疫性，仍需要建立更加優(yōu)化改進(jìn)的小鼠模型。
HCV進(jìn)入細(xì)胞需要通過Claudin-1受體密切接觸介導(dǎo)實現(xiàn)，用人肝嵌合uPA-SCID小鼠研究發(fā)現(xiàn)，針對該受體的阻斷抗體可達(dá)到抑制病毒復(fù)制，降低感染肝細(xì)胞數(shù)量的作用。另外，在NRG-Fah小鼠中，借助AAV載體表達(dá)針對多個HCV特異性的中和抗體聯(lián)合應(yīng)用的療法，也具有降低HCV復(fù)制和病毒感染量的作用。而且，用MUP（Major urinary protein)啟動子表達(dá)uPA 建立MUP-uPA/SCID/beige小鼠，應(yīng)用該模型研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染可引起約25%的感染小鼠形成原發(fā)性肝腫瘤，這為研究肝腫瘤的形成機(jī)制提供了獨(dú)特的機(jī)會。
另外，人鼠肝嵌合小鼠模型也可應(yīng)用于藥物代謝的研究。許多藥物是通過肝臟進(jìn)行代謝，小鼠和人肝的代謝機(jī)制是明顯不同的。因此，簡單應(yīng)用小動物模型研究藥物代謝動力學(xué)顯然是不適合的。目前，許多人鼠嵌合肝模型就是通過破壞小鼠肝細(xì)胞的方式，結(jié)合脾內(nèi)注射人肝細(xì)胞來開展的。例如，一種新型免疫缺陷小鼠是通過利用白蛋白（Alb) 啟動子控制表達(dá)白喉毒素受體（DTR），構(gòu)建Alb-TRECK/SCID小鼠。當(dāng)注射白喉毒素后，小鼠肝臟很快被破壞，然后用人肝細(xì)胞取而代之。這類人鼠肝嵌合小鼠模型具有如同人肝一樣的藥物代謝特征。由于種系的不同造成的原因， 可用于人的藥物如利尿磺胺，對小鼠則是有毒性的。然而，應(yīng)用人肝嵌合的TK-NOG小鼠則有有助于解決這一問題，并應(yīng)用于人藥物的毒性試驗。如研究表明，利尿磺胺藥物對TK-NOG小鼠的毒性作用降低，與在人體內(nèi)觀察的副反應(yīng)相似。
中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠在腫瘤生長和癌癥免疫學(xué)等研究領(lǐng)域有哪些方面應(yīng)用？
俞博士：在過去的50多年時間，研究者們通過將來自病人腫瘤移植到無胸腺裸鼠及SCID免疫缺陷小鼠的研究方法，已經(jīng)成為驗證與評估人癌癥疾病治療效果方面非常有價值的工作。不幸的是，無胸腺裸鼠仍然保留了小鼠的先天免疫系統(tǒng)和B細(xì)胞，特別是保留能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的小鼠NK細(xì)胞。而包括缺失NK細(xì)胞的免疫缺陷IL2rg小鼠的建立，則有利于成功移植各種人腫瘤，包括腫瘤細(xì)胞系，原位實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤等領(lǐng)域的研究及應(yīng)用。
腫瘤病人來源的異種移植（PDX）至免疫缺陷IL2rg小鼠，可以實現(xiàn)保留原位腫瘤的異質(zhì)性和基質(zhì)效果。由于PDX小鼠中存在有人腫瘤侵潤免疫細(xì)胞，該模型成為腫瘤微環(huán)境中的非自發(fā)的異質(zhì)性現(xiàn)象的貢獻(xiàn)之一。因此，免疫缺陷IL2rg小鼠為研究腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用提供了機(jī)會，研究者們可以通過移植人腫瘤細(xì)胞及免疫系統(tǒng)至免疫缺陷小鼠，探索腫瘤是如何與免疫系統(tǒng)相互作用，腫瘤免疫逃逸的機(jī)制，免疫調(diào)節(jié)潛在療法的機(jī)理。當(dāng)然，PDX腫瘤經(jīng)過再次傳代后，迅速損失原腫瘤基質(zhì)，而被小鼠基質(zhì)細(xì)胞所替代。
基于腫瘤細(xì)胞系在人源化小鼠模型而獲得的腫瘤及免疫系統(tǒng)相互作用的相關(guān)結(jié)果，由于其缺乏腫瘤異質(zhì)性等因素，因而存在一定的應(yīng)用局限性。而進(jìn)一步改進(jìn)的腫瘤模型如PDX腫瘤模型則有助于解決這方面的不足，因為原位移植的PDX腫瘤模型可以實現(xiàn)腫瘤組織的異質(zhì)性與更加完整腫瘤微環(huán)境相結(jié)合的目的。
然而，如何獲得足夠量的自體同源的HSCs開展大批量的研究，則是構(gòu)建人源化小鼠應(yīng)用于PDX研究中一個潛在不利因素。最近，一種從臍帶血或G-CSF刺激并轉(zhuǎn)染tat-MYC和tat-Bcl2融合蛋白的PBL，分離獲得擴(kuò)增的HSCs的方法，可以在體外擴(kuò)增HSCs。如XactMice， 即將經(jīng)體外擴(kuò)增的HSCs移植的NSG小鼠， 再移植來自頭頸部體鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）病人的PDX樣品，腫瘤在此類小鼠中有人CD45陽性CD151陽性細(xì)胞，以及增加的淋巴血管密度，提示在小鼠的腫瘤微環(huán)境中人免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)再生形成。
人源化小鼠應(yīng)用T細(xì)胞編輯方面的研究也已成為現(xiàn)實。一種通過作用于免疫系統(tǒng)達(dá)到改善抗腫瘤免疫的機(jī)制，是通過導(dǎo)入TCR或嵌合抗原受體（CAR）基因改造T細(xì)胞方法，達(dá)到重新提升T細(xì)胞特異性的T細(xì)胞療法。CAR療法是基于構(gòu)建針對特異性抗原T細(xì)胞受體，該抗原受非依賴于MHC限制，使得TCR被引導(dǎo)至選擇的任何靶點(diǎn)。雖然，T細(xì)胞再定位的療法已經(jīng)用于臨床，人源化小鼠模型則可作為優(yōu)化TCR/CAR調(diào)節(jié)的藥效及安全，以及擴(kuò)大癌癥治療范圍等的評估方法。
將腫瘤特異性TCR通過轉(zhuǎn)基因（Tg) 方式導(dǎo)入T細(xì)胞的優(yōu)化機(jī)制，已經(jīng)在人源化小鼠模型進(jìn)行了研究。關(guān)于Tg TCR療法的安全性考慮問題，是Tg TCR與內(nèi)源性TCR之間可能發(fā)生錯誤配對，引起脫靶特異性，從而增加了細(xì)胞毒性。有研究者利用ZFN方法將內(nèi)源性TCRa和TCRb基因破壞后，表明在移植源WT-1陽性白血病的Hu-PBL-SCID模型中，編輯的Tg T細(xì)胞具有只表達(dá)WT-1腫瘤特異性TCRs。
人源化小鼠也可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的評價工具。利用檢查點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)制作為腫瘤免疫調(diào)節(jié)療法，已經(jīng)成為當(dāng)前最具潛力的研究領(lǐng)域。 目前在臨床上成功研制的兩個免疫檢查點(diǎn)單克隆抗體，如抗細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）單抗， 該抗體具有阻斷抑制通路，激活T細(xì)胞的作用；和抗程序化細(xì)胞死亡-1（anti-PD-1)單抗，可以達(dá)到阻斷PD-1與其程序化細(xì)胞死亡-配體1（PD-L1）相互作用。這些阻斷作用在抵抗黑色素瘤方面都具有明顯效果，但不是所有的病人對CTLA-4和抗PD-1治療都有反應(yīng)。因此，移植腫瘤的人源化小鼠被應(yīng)用，可以成為更好地揭示阻斷與免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制，以及測試與評價免疫調(diào)節(jié)劑效果與效率的工具。
最近的研究表明，應(yīng)用人源化小鼠分析免疫調(diào)節(jié)抗體的藥物動力學(xué)，以及抗腫瘤的特性，如在人結(jié)直腸HT-29癌細(xì)胞和異源人PBMCs移植的Rag2 IL2rg小鼠中，或移植病人來源的胃癌組織及自體PBMCs的小鼠，利用抗hCD137和抗PD-1單抗聯(lián)合作用具有顯著降低腫瘤生長的效果。
中國實驗動物信息網(wǎng)：應(yīng)用基因修飾方法建立人源化小鼠模型有哪些基本技術(shù)方法？賽業(yè)模式生物在這方面有什么優(yōu)勢與貢獻(xiàn)？
俞博士：前面介紹的人源化小鼠模型多是基于免疫缺陷小鼠基礎(chǔ)上，通過移植人細(xì)胞和組織實現(xiàn)的。通過基因修飾的技術(shù)方法，將人相關(guān)基因直接替換小鼠相關(guān)基因，建立人源化小鼠模型的方式，也已廣泛應(yīng)用于人基因功能研究、腫瘤免疫藥物研發(fā)、感染性疾病建立以及藥物臨床前評估與考核等生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究。比如，通過對免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）進(jìn)行人源化修飾，構(gòu)建能與抗CTLA4和PD1人源化抗體相互作用的人源化小鼠，為這類抗體藥物的臨床前篩選與評估提供了有效的工具。通過對不感染小鼠，但感染人病原體感染分子機(jī)理的研究，探索建立可被這些病原體感染的人源化小鼠模型，為在小鼠體內(nèi)研究其發(fā)病過程，建立有效疾病的防御與治療評價體系提供了可能性。如基于對引起中東呼吸道綜合癥（MERS)的冠狀病毒感染人細(xì)胞的分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，利用基因打靶技術(shù)，將冠狀病毒感染結(jié)合人細(xì)胞DPP4基因替換小鼠的相應(yīng)基因，構(gòu)建了人源化DPP4敲入小鼠，研究表明，該人源化小鼠對冠狀病毒具有易感性，并可作為篩選評估MERS相應(yīng)中和抗體效果的工具。
另外，近年來在人源化抗體制備的快速發(fā)展中，利用基因修飾的方法構(gòu)建可制備人抗體的人源化小鼠，已經(jīng)成為抗體藥物研發(fā)的重要研究領(lǐng)域。其中最為成功的例子為美國Regeneron制藥公司研發(fā)的VelocImmune小鼠。該人抗體人源化小鼠的制備策略是通過多輪基因打靶操作過程，分別用人抗體重鏈/輕鏈可變區(qū)替換小鼠同源區(qū)域獲得。該人源化小鼠在受到相應(yīng)抗原刺激后，可生產(chǎn)針對特異性抗原的含人抗體可變區(qū)部分，以及小鼠抗體恒定區(qū)的人源化抗體。研究表明，與其他體外DNA重組方法獲得的人抗體比較，這類通過人源化小鼠篩選獲得人抗體具有更佳有效的親和力與活性。
目前，應(yīng)用基因修飾的方式構(gòu)建人源化小鼠模型的技術(shù)方法主要有以下幾種，1. 借助原核注射的方法，將人基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，達(dá)到表達(dá)人基因的目的；2. 利用小鼠ES細(xì)胞系，進(jìn)行傳統(tǒng)基因打靶的方法，達(dá)到用人基因定點(diǎn)替換小鼠基因或插入人基因的目的；3. CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，通過原核注射方式，構(gòu)建特殊目的的人源化小鼠模型；4. Turobo KO優(yōu)化的ES打靶技術(shù)，該技術(shù)是賽業(yè)生物對傳統(tǒng)ES打靶技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其在構(gòu)建人源化小鼠模型的研制中更加高效穩(wěn)定。由于以上幾種技術(shù)方法都有其各自的優(yōu)勢與不足，因此，在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)各自的研究需要與目的選擇更加適合方法。比如，雖然原核注射的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建方法本身方便，快速，成本低，但因DNA隨機(jī)插入的特性，可能對內(nèi)源性基因干擾引起的風(fēng)險，以及插入位置效應(yīng)對基因表達(dá)的可能抑制影響，可能導(dǎo)致對以后研究帶來的不確定性因素。傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)因其成熟性與穩(wěn)定性，一直都是基因修飾小鼠制備的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，由于該方法技術(shù)要求較高，操作步驟多而復(fù)雜，使其制備周期相對較長，也不利于其推廣應(yīng)用。CRISPR/Cas9技術(shù)因其設(shè)計與操作相對簡單，對一般基因修飾的效率高，且沒有物種限制的特性，大大促進(jìn)了其在人源化模式動物模型的研制。當(dāng)然，因為存在脫靶效應(yīng)，以及對復(fù)雜修飾效果難控制等風(fēng)險也在一定程度上限制該技術(shù)等應(yīng)用。在傳統(tǒng)ES打靶技術(shù)的基礎(chǔ)上，賽業(yè)生物經(jīng)過多年的探索努力，推出的Turobo KO基因打靶技術(shù)，包括建立生殖遺傳高效的TetraOne ES細(xì)胞系，以及Neo抗性篩選基因自刪除系統(tǒng)等技術(shù)改進(jìn)，不僅保留了傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)的穩(wěn)定性與成功率，而且提高其制備過程的有效性，使ES打靶技術(shù)的制備周期大大縮短。因此，賽業(yè)生物Turobo KO基因打靶技術(shù)的建立，將更加有助于構(gòu)建相對復(fù)雜的基因修飾人源化小鼠模型，為應(yīng)用基因修飾技術(shù)制備不同類型的人源化小鼠模型提供了更多的選擇。目前，Turobo KO基因打靶技術(shù)的建立也是賽業(yè)生物有別于其他同類供應(yīng)商的明顯優(yōu)勢之一。
中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠模型的研究與應(yīng)用未來需要解決的問題是什么？
俞博士：對建立在免疫缺陷小鼠基礎(chǔ)上的人源化小鼠模型需要從以下幾個方面進(jìn)一步的改進(jìn)與優(yōu)化，1. 降低小鼠的先天免疫，使其達(dá)到更加有效的移植具有功能性的人細(xì)胞，組織和免疫系統(tǒng)，表達(dá)人分子，如能于供體人細(xì)胞相配的HLA等位基因，從而更加有利于人免疫發(fā)育和功能；2. 構(gòu)建有助于免疫缺陷IL2rg小鼠的人相關(guān)淋巴結(jié)構(gòu)（如含生發(fā)中心的淋巴結(jié)）發(fā)育，使人造血干細(xì)胞成為發(fā)揮完整功能性人免疫反應(yīng)；3. 研究尋找與替換人免疫系統(tǒng)形成相關(guān)的特異性因素，因為這些因素可能是小鼠自身缺乏的，但卻是理想人細(xì)胞分化與功能需要的；4. 進(jìn)一步評估與驗證PDX和PDX/免疫模型應(yīng)用實際效果，使其實現(xiàn)能真實反映病人腫瘤微環(huán)境與免疫系統(tǒng)相互作用的機(jī)制，為探索新的有效腫瘤免疫治療方法與策略提供依據(jù)和基礎(chǔ)；5. 由于移植物抗宿主疾病在許多人免疫移植模型中都會發(fā)生，因此，建立降低或防止移植物抗宿主疾病發(fā)生的有效方法，為人源化小鼠模型作為有效的臨床前研究的工具，以及未來新藥開發(fā)與應(yīng)用創(chuàng)造了條件。
而對于基因修飾人源化小鼠模型研制，如何篩選到合適有效的相關(guān)靶基因，對修飾靶基因自身的結(jié)構(gòu)，剪切及表達(dá)特點(diǎn)的深入了解，基因修飾打靶策略的選擇，以及對目前不同基因修飾技術(shù)與方法的改進(jìn)與優(yōu)化等因素，都將是基因修飾人源化小鼠模型未來需要探索解決的問題。
總之，人源化小鼠模型等建立促使了人感染性疾病，癌癥，再生醫(yī)學(xué)，移植與宿主，過敏和免疫等領(lǐng)域的研究發(fā)展。利用人源化小鼠模型最終有可能實現(xiàn)臨床上真正“個性化” 醫(yī)療的目的。
中國實驗動物信息網(wǎng)：非常感謝俞博士接受中國實驗動物信息網(wǎng)的特邀專訪。
俞曉峰 博士，高級科學(xué)家
俞曉峰博士現(xiàn)任賽業(yè)模式生物副總裁、高級科學(xué)家，負(fù)責(zé)基因修飾模式動物的研發(fā)與技術(shù)服務(wù)等工作。
俞博士在遺傳基因模式動物領(lǐng)域有超過20年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。加入賽業(yè)生物前，俞博士2010-2013年任職于美國應(yīng)用干細(xì)胞（ASC）公司，擔(dān)任研發(fā)總監(jiān)，負(fù)責(zé)基因修飾模式動物的研發(fā)與定制服務(wù)，并在中國子公司斯坦福生物科技擔(dān)任副總裁一職。2009-2010任紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。
2003-2009期間任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學(xué)家和項目經(jīng)理負(fù)責(zé)參與了基因修飾小鼠模型研發(fā)方案與策略設(shè)計、項目管理、技術(shù)人員指導(dǎo)與培訓(xùn)、以及客戶服務(wù)和技術(shù)咨詢等方面工作，2007年起負(fù)責(zé)開發(fā)了p53基因不同點(diǎn)突變的人源化腫瘤小鼠模型庫項目。2000年任美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位。
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