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美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：N-異丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）是世界范圍內(nèi)普遍使用的抗氧化劑，是輪胎橡膠中的添加劑，容易排放到周圍環(huán)境中。目前，尚未有關(guān)于IPPD對魚類亞急性毒性的研究。使用斑馬魚胚胎（受精后2小時）暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200 mg/L的濃度的IPPD 5天以研究其對胚胎發(fā)育、生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）和下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸的破壞的毒性效應。結(jié)果表明，IPPD暴露降低了斑馬魚的孵化率，削弱了運動能力，減少體長，并導致斑馬魚胚胎出現(xiàn)多種畸形。斑馬魚幼體暴露于IPPD后，GH/IGF和HPT軸相關(guān)基因的表達發(fā)生改變。同時，IPPD顯著降低了仔魚體內(nèi)甲狀腺素（T4）和3,5,3′-三碘甲狀腺原氨酸（T3）的含量，表明HPT軸處于紊亂狀態(tài)。此外，IPPD 的治療降低了超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 的酶活性以及谷胱甘肽 (GSH) 的水平。而暴露于IPPD后丙二醛（MDA）的含量升高。本研究表明，IPPD誘導氧化應激，引起發(fā)育毒性，并破壞斑馬魚的GH/IGF和HPT軸，這可能導致發(fā)育障礙和生長抑制。
關(guān)鍵詞：斑馬魚 IPPD 生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）軸 下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸 氧化應激
簡介：橡膠抗氧劑是添加到橡膠及其制品中的一種添加劑，具有抑制氧化、耐熱或耐光、防止老化的作用，從而延長制品的貯存期和使用壽命。由于輪胎的磨損，這些抗氧化劑及其化合物很容易隨路面雨水釋放到水體中。相關(guān)研究報告稱，當銀鮭向上游遷徙并產(chǎn)卵時，每年有90%的鮭魚突然死亡。如果碰巧遇到大雨，它會加快鮭魚的死亡時間，大量鮭魚將在短短幾個小時內(nèi)死亡。研究人員認為，這與輪胎生產(chǎn)過程中添加的抗氧劑6PPD產(chǎn)生的化合物N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-對苯二胺(6PPD)-醌密切相關(guān)。根據(jù)不同的標準，橡膠抗氧劑可以分為不同的種類，其中芳香族仲胺（Ar-SAs）是最常用的一種。就化學結(jié)構(gòu)的變化而言，Ar SA可分為取代二苯胺（S-DPAs）和取代對苯二胺（S-PPD）。后者是橡膠工業(yè)中最有效和最常用的抗氧化劑和抗臭氧劑。N-異丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）和6PPD都是抗氧化劑的芳香族仲胺（Ar-SAs），也是使用最廣泛的輪胎抗氧化劑。橡膠釋放到廢水中是非常令人擔憂的，因為水載污染物會影響人類和動物的健康以及我們的自然生態(tài)系統(tǒng)。IPPD用作橡膠中的抗氧化劑，主要用于汽車輪胎，世界上IPPD的年產(chǎn)量為10000–15000噸。IPPD 的 log 辛醇-水分配系數(shù) (log Kow) 值為 3.88，在2～16h的不同純度水中測定了IPPD的半衰期值。很少有研究關(guān)注IPPD的毒性，其在環(huán)境中的水平尚不清楚。迄今為止，有關(guān) IPPD 毒性的信息很少見。 沒有關(guān)于人類急性吸入或口服暴露IPPD后影響的數(shù)據(jù)。在兩項簡要報告的研究中，大鼠經(jīng)口IPPD途徑具有中等毒性，而家兔經(jīng)皮途徑具有極低毒性。IPPD是動物和人類的皮膚致敏劑。體外哺乳動物細胞誘變試驗表明，IPPD具有誘發(fā)染色體畸變的潛力。根據(jù)急性毒性結(jié)果，虹鱒魚和黑頭鰷魚的 96 h 致死濃度 50 (LC50) 為 0.34 至 0.43 mg/L。并且沒有關(guān)于 IPPD 對魚類的亞急性影響的信息。 IPPD是否對水生生物有明顯的發(fā)育毒性尚不清楚。雖然生長和發(fā)育是復雜的遺傳和分子相互作用的結(jié)果，因此是各種因素的組合，但魚類的幾乎所有主要生理過程，包括能量平衡、免疫功能、繁殖以及主要生長，都受生長激素和生長激素/胰島素樣生長因子（GH/IGF）軸的調(diào)節(jié)。因此，生長激素/胰島素樣生長因子軸作為魚類生長的關(guān)鍵神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子引起了廣泛關(guān)注。此外，甲狀腺激素（THs）在體細胞生長、發(fā)育、代謝、孵化后變態(tài)和行為控制中起著至關(guān)重要的作用。甲狀腺激素的合成、分泌、運輸和代謝受下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸的調(diào)節(jié)。眾所周知，沒有健康的生理功能，魚就無法生長。 含有抗氧化酶和非酶抗氧化劑的抗氧化防御系統(tǒng)對魚類的生長性能也起著重要作用。在這項研究中，斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的 IPPD 以觀察發(fā)育和生長毒性。 定量測定主要影響生長發(fā)育的GH/IGF和HPT軸所涉及的激素和基因表達的變化。并檢測到參與抗氧化防御系統(tǒng)的抗氧化酶。 本研究的目的是研究斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)、GH/IGF 和 HPT 軸對 IPPD 暴露的反應機制。
發(fā)育毒性：IPPD 對斑馬魚的 96 小時 LC50 為 1.2 mg/L，95% 置信區(qū)間為 0.9-1.5 mg/L，根據(jù)全球化學分類和標簽協(xié)調(diào)手冊 (GHS) 分類標準，IPPD 對斑馬魚具有劇毒。三個暴露組的孵化率均下降，0.1200 mg/L處理組的孵化率比對照組低39.76%。
圖1、暴露于 IPPD (0, 0.0012, 0.0120 和 0.1200?mg/L) 的斑馬魚（a） 48?h的孵化率、(b) 60 秒內(nèi)自主運動、(c) 120?h胚胎的體長。
與對照組相比，所有 IPPD 治療組的自發(fā)運動均顯著降低，0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 治療組的自發(fā)運動分別降低了 28.5%、31.17% 和 68.5%。暴露120?h后，0、0.0012、0.0120和0.1200?mg/L的平均體長分別為4.15（?±?0.16）、4.02（?±?0.16）、3.85（?±?0.10）和3.75（?±?0.06）mm。暴露于 0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 后觀察到顯著下降。記錄了IPPD引發(fā)斑馬魚幼體的畸形。與對照組相比，所有治療組均觀察到典型畸形，包括彎尾畸形（BT）、脊柱彎曲畸形（BS）和卵黃囊腫（VC）。此外，觀察表明，畸形可能以一種形式出現(xiàn)，也可能同時以多種形式出現(xiàn)。
GH/IGF 軸上的基因轉(zhuǎn)錄譜：暴露于IPPD后，gh的轉(zhuǎn)錄水平（1.13、1.11和1.04倍）沒有顯著變化。同樣，經(jīng)IPPD處理后，ghrh的表達也沒有顯著變化。ghra 基因表達水平（0.77、0.91 和 0.57 倍）在 0.0012 和 0.1200?mg/L 處理組中下調(diào)，而 ghrb（1.68、1.58 和 1.09 倍）在 0.0012 和 0.0120?mg/L 暴露組中顯著上調(diào)。
圖 2、 斑馬魚胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 下 96?h 的 GH/IGF 軸相關(guān)基因的 mRNA 表達譜。
在三個IPPD暴露組中，igf1的表達（0.32、0.27和0.47倍）顯著下調(diào).。同樣，在三個IPPD暴露組中，igf1ra（0.09、0.09和0.25倍）和igf1rb（0.12、0.11和0.68倍）的表達也顯著下調(diào)。igf2a（1.17、1.00和0.68倍）和igf2b（1.15、1.07和0.57倍）的轉(zhuǎn)錄水平僅在0.1200?mg/L IPPD組中下調(diào)。與 igf2a 和 igf2b 類似，igf2r 的轉(zhuǎn)錄水平（1.25、1.18 和 0.42 倍）僅在 0.1200?mg/L IPPD 組中下調(diào)。igfbp1a（0.93、0.79和0.19倍）和igfbp1b（1.27、1.18和0.22倍）的轉(zhuǎn)錄水平僅在0.1200?mg/L處理組顯著下調(diào)。在三個IPPD暴露組中，igfbp2a（0.33、0.44和0.48倍）和igfbp6b（0.58、0.42和0.28倍）的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。igfbp5a的基因表達（0.89、1.42和1.19倍）僅在0.0120?mg/L IPPD組中上調(diào)。 IPPD對igfbp7的表達無顯著影響（1.09、1.26和1.23倍）。
HPT軸基因轉(zhuǎn)錄譜：與對照組相比，所有暴露組的tshβ（0.69、0.59和0.53倍）和crh（0.64、0.52和0.37倍）基因均呈濃度依賴性下調(diào)。
圖 3 、斑馬魚胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L 的IPPD 96?h 時，HPT 軸相關(guān)基因的 mRNA 表達譜。暴露于 0.0012?mg/L 和 0.1200?mg/L IPPD 顯著上調(diào) dio2 的表達（1.30、1.17 和 1.31 倍）。同樣，三個 IPPD 暴露組中，tr?α（0.54、0.49 和 0.38 倍）和 tr?β（0.55、0.46 和 0.40 倍）的表達顯著下調(diào)。
GH和IGF含量：與對照組相比，三個IPPD治療組的GH激素水平顯著降低。同樣，與對照組相比，暴露于IPPD顯著降低IGF的激素水平。仔魚暴露120小時后測量全身THs水平。 各治療組T3、T4總水平呈下降趨勢。同時，與對照組相比，所有暴露組的T3與T4比率均顯著降低。
圖4、 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑馬魚仔魚GH（a）和IGF（b）激素水平
圖5、（a） 甲狀腺素（T4）含量；（b） 3,5,30-三碘甲狀腺原氨酸（T3）含量；（c） 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑馬魚仔魚的T3/T4比值。
氧化應激：暴露于 IPPD 會導致 MDA 和 GSH 水平以及 SOD 和 CAT 的酶活性發(fā)生顯著變化。與對照組相比，所有治療組的SOD活性均呈劑量依賴性下調(diào)，CAT活性均顯著下調(diào)。三個治療組的MDA含量均有不同程度的升高。 而0.0012和0.0120?mg/L組GSH含量較對照組降低。
圖 6. 暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200?mg/L IPPD 直至 120 hpf 的斑馬魚仔魚 SOD (a)、CAT (b) 和 MDA (c)、GSH (d) 水平的變化。
討論：IPPD對生物體的毒性尚不清楚。根據(jù)幾項簡短的研究，IPPD對大鼠具有中等毒性，對家兔具有極低毒性。IPPD是動物和人類的皮膚敏化劑，有可能誘發(fā)哺乳動物細胞染色體畸變。根據(jù)魚類的急性毒性結(jié)果，IPPD對藍鰓太陽魚、虹鱒和黑頭鯉具有高度毒性。目前沒有關(guān)于IPPD對魚類亞急性影響的信息。在本研究中，我們在實驗室條件下評估了IPPD對斑馬魚胚胎-仔魚生長發(fā)育階段的影響。對孵化率和體長有顯著影響，這表明胚胎發(fā)育直接延遲。自發(fā)運動是肌肉和運動神經(jīng)系統(tǒng)共同發(fā)育的結(jié)果，是評估化學品對魚類毒性的重要毒理學終點。我們還檢測到仔魚的自發(fā)運動減少。 因此，IPPD 暴露后自發(fā)運動的濃度依賴性減少可能意味著由于 IPPD 潛在的神經(jīng)發(fā)育毒性而導致的發(fā)育遲緩。 需要進一步的調(diào)查來證實這一觀察結(jié)果。多種環(huán)境化學物質(zhì)，如金屬元素、納米顆粒、持久性有機污染物、殺蟲劑，均可誘發(fā)脊柱彎曲等骨骼異常。脊柱畸形可能是由于健康肌肉骨骼系統(tǒng)發(fā)育所必需的肌節(jié)和/或肌球蛋白形成減少所致。在本研究中，IPPD引起的畸形可能是一種或多種機制的結(jié)果。由于確定畸形的機制不是本研究的目標，因此需要進一步的研究來調(diào)查它們。
暴露于IPPD的GH/IGF軸反應：在我們的研究中，暴露于IPPD后，仔魚的體長受到顯著抑制，這表明IPPD影響了仔魚的生長性能。生長激素/胰島素樣生長因子軸在魚類生長的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起主導作用。初始階段 GH/IGF 軸的任何缺陷都可能對魚類的生長產(chǎn)生永久性影響。 這種在脊椎動物發(fā)育早期形成的復雜生長系統(tǒng)主要由配體、受體和一些具有高親和力的結(jié)合蛋白組成。GH/IGF 軸由配體（胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子-II）、受體（胰島素樣生長因子-IR、胰島素樣生長因子-ⅡR）和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白）組成，以協(xié)調(diào)的方式調(diào)節(jié)幾乎所有細胞類型的增殖、分化和存活。GH/IGF 軸在調(diào)節(jié)魚類的體細胞生長和孵化后發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，被認為是環(huán)境污染物影響的指標。我們檢測了GH/IGF軸相關(guān)基因的表達。生長激素通過與肝臟中的生長激素受體 (GHR) 結(jié)合來刺激 IGF 的合成和釋放。 斑馬魚有兩種主要的 GHR（ghra 和 ghrb）。gh 的表達影響兩種特定受體（ghra 和 ghrb）的表達。gh的表達沒有明顯變化，而ghra的表達明顯下調(diào)。 因此，ghrb的表達上調(diào)，以彌補ghra的不足，維持受體的平衡。生長激素釋放激素（ghrh）是促進垂體分泌GH的最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子。 ghrh的表達沒有顯著變化，表明ghrh可能不促進gh的表達。IGFs家族，包括IGFI和IGFII，是脊椎動物中進化上保守的肽，通過保守的信號通路發(fā)揮作用。斑馬魚基因組包含哺乳動物IGF2的兩個同源物（igf2a和igf2b）。這些IGFs參與細胞生長和代謝，IGFs的生物活性和生物利用度受IGFBPs調(diào)控。IGFBPs對IGFs的親和力高于對IGFRs的親和力。 IGFBP家族有6個成員，包括IGFBP1-IGFBP6。 哺乳動物通常有六種 IGFBP，而其他一些物種則缺乏其中的一種或多種。例如，雞和斑馬魚沒有 IGFBP 4 基因。在我們的研究中，IGFs（igf1、igf2a和igf2b）基因和IGF蛋白水平以及IGFR（igf1ra、igfrb和igf2r）的下調(diào)可能是IGFBPs（igfbp2a、igfbp1a和igfbp6b）下調(diào)的結(jié)果。IGFBPs通過影響IGF的轉(zhuǎn)運而影響IGF的正常水平和生理功能，從而導致生長發(fā)育受損。我們使用qRT PCR檢測IGFBPs（igfbp1b、igfbp2a、igfbp6b、igfbp1a、IGFBP7和igfbp5a）的表達。其中igfbp2a、igfbp6b和igfbp1a顯著下調(diào)，igfbp7和igfbp5a輕微上調(diào)。IGFBP-1是一種與IGF結(jié)合的分泌蛋白，在調(diào)節(jié)體細胞的生長、發(fā)育和衰老中起著至關(guān)重要的作用。qRT-PCR結(jié)果表明斑馬魚中igfbp1a的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，表明IPPD暴露后斑馬魚的生長發(fā)育受到抑制。斑馬魚IGFBP-2是一種對IGF-I和IGF-II（而非胰島素）具有高度親和力的基因編碼蛋白，在體外可抑制IGF誘導的細胞生長。本研究中觀察到的igfbp2a的顯著下調(diào)表明IPPD對斑馬魚的早期胚胎發(fā)育造成不利影響。研究表明，IGFBP6s（igfbp6a和igfbp6b）是一種抑制性蛋白質(zhì)，可能通過結(jié)合IGF抑制IGF在體內(nèi)的作用。在我們的研究中，igfbp6b轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可能會影響IGF的正常功能。我們的結(jié)果表明，暴露于IPPD后，參與GH/IGF軸的基因表達受到干擾，這可能導致斑馬魚胚胎的生長抑制。
暴露于IPPD的HPT軸響應：在脊椎動物中，除GH/IGF軸外，HPT軸在生長發(fā)育過程中也起著重要作用，負責維持正常的甲狀腺激素濃度。HPT軸功能的改變會影響新陳代謝、滲透調(diào)節(jié)和發(fā)育。在本研究中，暴露于IPPD后，斑馬魚仔魚的全身THs（T4和T3）水平降低。我們的結(jié)果表明，暴露于IPPD可干擾體內(nèi)甲狀腺激素。IPPD破壞了斑馬魚仔魚的甲狀腺系統(tǒng)。qRT-PCR檢測HPT軸相關(guān)基因的表達。甲狀腺濾泡中T4和T3的合成和釋放受垂體促甲狀腺激素（tsh）的控制。在哺乳動物中，促甲狀腺素釋放激素（trh）或促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（crh）是tsh的主要調(diào)節(jié)者，而在硬骨魚中，tsh的分泌由crh調(diào)節(jié)。因此，crh和tshβ的下調(diào)可能與甲狀腺激素含量降低有關(guān)。因此，本研究中觀察到的仔魚全身總甲狀腺激素（T4和T3）含量的降低可能是由于crh和tshβ表達下調(diào)所致。碘甲狀腺原氨酸脫碘酶 (dios) 負責甲狀腺激素的激活和失活，甲狀腺激素在脊椎動物的循環(huán)和外周 THs 水平中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。以往的研究表明，脫碘酶的轉(zhuǎn)錄水平是暴露于環(huán)境污染物的魚類甲狀腺破裂的敏感分子生物標記物。THs在維持脊椎動物的正常生理活動中發(fā)揮著重要作用，THs與肝臟、眼睛和生殖器官等各種器官中的甲狀腺激素受體（thrα和thrβ）結(jié)合并激活，從而誘導生理活動和行為。我們的研究結(jié)果表明，在不同濃度的 IPPD 處理后，thrα 和 thrβ 的表達水平顯著下調(diào)，這可能會導致斑馬魚仔魚的生長抑制和發(fā)育障礙。氧化應激也會影響水生生物的生長、生存和發(fā)育。抗氧化防御系統(tǒng)由酶和非酶成分組成。 酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx)，而還原型谷胱甘肽 (GSH) 是重要的非酶抗氧化劑之一。SOD和CAT活性的顯著降低表明，暴露于IPPD后，斑馬魚仔魚體內(nèi)活性氧（ROS）和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被破壞。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，其含量可以反映細胞器的抗氧化能力。谷胱甘肽含量的顯著降低表明抗氧化劑的過度消耗，因此導致抗氧化防御能力的顯著降低。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要氧化產(chǎn)物。 本研究中 MDA 生成的增加表明，暴露于 IPPD 后可誘導氧化應激。 鑒于氧化應激與生長性能之間的關(guān)系，可以推斷氧化應激是IPPD對生長的毒性作用之一。
結(jié)論：我們的研究表明，暴露于IPPD的斑馬魚胚胎表現(xiàn)出明顯的生長抑制，并改變了GH/IGF的激素含量以及GH/IGF和HPT軸相關(guān)基因的表達水平。我們可以推斷，IPPD 誘導的生長抑制是由 GH/IGF 和甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)破壞的綜合作用造成的。此外，IPPD的處理顯著影響斑馬魚胚胎的抗氧化狀態(tài)，其機制需要進一步研究。鑒于IPPD作為橡膠抗氧化劑的廣泛使用，其殘留物存在于環(huán)境中，需要進一步研究，以評估IPPD單獨或與其他化學品組合使用對魚類的長期影響。
原文出自：IPPD-induced growth inhibition and its mechanism in zebrafish - ScienceDirect
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